蛋白脱铁铁蛋白的Cryo-EM图。图片来源：Paul Emsley / MRC分子生物学实验室
改变分子成像技术的改变游戏规则的技术，称为冷冻电子显微镜，已经产生了迄今为止最清晰的图像，并且首次发现了蛋白质中的单个原子。
通过使用低温电子显微镜（cryo-EM）达到原子分辨率，研究人员将能够以前所未有的细节了解蛋白质的工作原理，而这些工作原理是其他成像技术（例如X射线晶体学）无法轻易检查的。
科学家说，上个月底两个实验室报告的这一突破巩固了cryo-EM作为绘制蛋白质3D形状的主要工具的地位。最终，这些结构将帮助研究人员了解蛋白质如何在健康和疾病中起作用，并导致产生副作用更少的更好的药物。
的确，这确实是一个里程碑。真的没有什么可打破的了。这是最后的决议屏障，”霍尔格斯塔克，在马克斯普朗克生物物理化学研究所在哥廷根，德国，生物化学和电子显微镜谁领导的一个研究说，1。另外两个由英国剑桥医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu领导。两者均于5月22日发布在bioRxiv预印服务器上。
“真正的“原子分辨率”是一个真正的里程碑，”加拿大多伦多大学的结构生物学家约翰·鲁宾斯坦补充说。由于其他挑战，例如蛋白质的灵活性，获得许多蛋白质的原子分辨率结构仍然是艰巨的任务。他补充说：“这些预印本显示了如果可以解决这些其他局限性，人们将会去哪里。”
突破界限
Cryo-EM是一种已有数十年历史的技术，它通过在电子样品上发射电子并记录所得图像来确定其形状。检测跳动电子的技术和图像分析软件的进步催生了始于2013年左右的“分辨率革命”。这导致了比以往任何时候都更清晰的蛋白质结构，并且几乎与从X射线晶体学获得的蛋白质结构一样好。X射线晶体学是一种较老的技术，可以从被X射线轰击的蛋白质晶体的衍射图样推断出结构。
随后的硬件和软件改进导致cryo-EM结构的分辨率得到了更大的提高。但是科学家不得不在很大程度上依靠X射线晶体学来获得原子分辨率的结构。但是，研究人员可能要花费数月至数年的时间才能使蛋白质结晶，而且许多医学上重要的蛋白质也无法形成有用的晶体。相比之下，cryo-EM只需要蛋白质在纯化溶液中即可。
原子分辨率图的精确度足以准确识别蛋白质中单个原子的位置，分辨率约为1.2Ångströms（1.2×10 –10 m）。这些结构对于了解酶的作用方式以及利用这些见解来识别可阻断其活性的药物特别有用。
为了将cryo-EM推向原子分解，这两个团队研究了一种名为载铁蛋白的铁储存蛋白。由于其具有如岩石般的稳定性，该蛋白质已成为冷冻EM的试验床：以前的记录3分辨率为1.54ångströms的蛋白质结构。
然后，研究小组利用技术改进技术来更清晰地拍摄载铁蛋白。Stark的团队在一种仪器的帮助下获得了1.25-ångström的蛋白质结构，该仪器可确保电子在撞击样品之前以相似的速度传播，从而提高了所得图像的分辨率。Scheres，Aricescu及其小组使用了不同的技术来发射以相似速度传播的电子。他们还受益于一项技术，该技术可减少一些电子从蛋白质样品中逸出后产生的噪声，以及一种更灵敏的电子检测相机。Scheres说，它们的1.2-Ångström结构是如此完整，以至于他们可以从蛋白质和周围水分子中挑选出单个氢原子。
斯塔克认为，融合技术可以将分辨率提高到大约1Ångström，但幅度不会太大。他说：“低于1Å几乎无法达到冷冻电磁。” 他的团队估计，使用现有的最新技术来获得这种结构将需要“数百年的数据记录以及不切实际的计算能力和数据存储能力”。
认清
Scheres和Aricescu还测试了其简化形式的称为GABA A受体的蛋白质的改进。该蛋白位于神经元的膜中，是全身麻醉，焦虑药物和许多其他药物的靶标。去年，Aricescu的研究小组利用冷冻电镜的蛋白质映射到2.5埃4。但是使用新试剂盒后，研究人员获得了1.7-Ångström的分辨率，甚至在蛋白质的某些关键部位也获得了更高的分辨率。“就像剥去您的眼睛上的模糊感一样，” Aricescu说。“按照这个分辨率，ångström的每一半都会打开整个宇宙。”
该结构揭示了该蛋白质前所未有的细节-包括口袋中的水分子（一种名为组胺的化学物质位于其中）。“这是用于基于结构的药物设计的金矿，” Aricescu说，因为它表明了药物如何置换水分子，从而潜在地减少了药物的副作用。
Scheres说，GABA A的原子分辨率图不如载铁蛋白那么稳定，将是一个挑战。“我认为这是不可能的，但那是非常不切实际的，”因为需要收集大量的数据。但是其他改进，尤其是蛋白质样品的制备方法，可以为GABA A和其他生物医学上重要的蛋白质的原子分辨率结构铺平道路。蛋白质溶液被冻结在由金制成的微小网格上，对这些网格的改动可能会使蛋白质保持静止5。
东京大学的低温电磁专家Radostin Danev说：“每个人都对MRC-LMB和Max Planck团队所表现出的惊人水平感到非常兴奋和惊讶。” 但是他同意样品制备是该领域对更多摆动蛋白质的主要挑战。他说：“低于1.5Å甚至低于2Å的分辨率性能将在一段时间内仅对性能良好的样本保持可访问性。”
Scheres说，这些突破可能会巩固cryo-EM作为大多数结构研究的首选工具的地位。渴望原子分解结构的制药公司可能更倾向于使用冷冻EM。但斯塔克认为X射线晶体学将保留一定的吸引力。如果一种蛋白质可以被结晶（如果这是个很大的话），那么在短时间内生成与数千种潜在药物结合的蛋白质结构相对有效。但是，要生成足够的数据以用于超高分辨率的冷冻EM结构，仍需要花费数小时甚至数天的时间。
“每种技术仍然有优缺点，” Stark说。人们已经发表了许多论文和评论，他们说，冷冻电磁的这些最新进展将成为X射线的死亡信号。我不信。”